单分子SERS：第一次，测全了4个碱基的单分子基因测序

研究亮点：

1. 通过加电压将纳米粒子约束在纳米孔形成的hotspot里，实现稳定可重复的SERS测试。

2. 证明了单分子SERS对四个DNA碱基的检测和单分子碱基的识别。

表面增强拉曼光谱

表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced RamanSpectroscopy, SERS）用激光照射贵金属纳米结构时产生的局域等离子激元（称为hot spot）来激发并增强吸附在纳米结构表面的分子的拉曼信号，当纳米结构形成<10 nm的纳米间隙时（图1），间隙里面的hot spot的强度可以使SERS灵敏度达到单分子水平，在生物医学、环境探测方面有巨大的应用潜力。

图1. 在SiN纳米孔上的金bowtie纳米结构用作单分子SERS衬底，bowtie结构中的两个金纳米三角尖尖之间的间隙可以激发出能达到单分子SERS的hot spot。

单分子测序的机遇

在分析领域众多实际应用中，单分子测序(single-moleculesequencing，又称为第三代测序技术)是单分子SERS预期能大有作为的一个领域。基因测序大家都不陌生，孕妇怀孕过程中就可以在医院里定期做DNA测序以监测胎儿可能存在某些疾病的风险，这种测序通常需要收集人体液中大量的DNA并放在医院的大型测序仪器中操作完成。

而单分子测序则是通过加电压将电解液中的单根DNA穿过单个生物纳米孔（孔径几个纳米的圆筒状蛋白质，见图2），由不同DNA碱基堵塞纳米孔产生四个不同的电流水平来逐一读出DNA的每个碱基，进而将整根DNA链的碱基序列全部读出。这种单分子测序仪已经做到了手机大小的有USB接口的便携式测序仪(Oxford Nanopore Technologies)，市场潜力巨大，已经被在非洲的无国界医生用于分析伊波拉病毒。

这种单分子测序技术立刻被延伸到医疗需要更加巨大的单分子蛋白质测序，预期通过与医院的数据库连接，手持式单分子蛋白质测序仪在未来能够成为像血压计一样的个人化医疗仪器，病人在家中就能自我测序体检，将重大疾病（如癌症）确诊在早期可治疗阶段，这将是生物医疗领域的又一个革命性突破！

图2. （上）纳米孔单分子测序仪原理图，（下）圆筒状蛋白质生物纳米孔示意图以及生物纳米孔测到的对应不同碱基的电流水平。

但是，蛋白质由20个不同的氨基酸组成，要分辨出20个不同的电流水平几乎不可能。目前各大研究机构和公司正在研究使用荧光标记这20个氨基酸并通过不同波长的单分子荧光来辨别它们，但是仍然难于登天，一来将不同染料分子连接上蛋白质链的每个氨基酸已经是接近不可能的任务，二来荧光的发光峰太宽，以至于邻近的不同染料分子发出来的不同波长的荧光会混合起来像白光一样难以分辨其中的组分，即所谓的cross-talk现象（图3）。

就像图1所示，单分子SERS正好能够解决荧光的这两个问题：SERS无需标记且拉曼峰非常窄所以避免了cross-talk。虽然目标是测试蛋白质中的单个氨基酸，但是作为起步，仍然以DNA作为待测物，于是问题变成：怎么在溶液的环境下测到单个DNA碱基的SERS？

图3. 荧光cross-talk现象。

流体中单分子SERS的困难

目前能达到单分子灵敏度的SERS体系通常需要有10 nm以下的纳米间隙，大概分为两类：一是基于胶体的金属纳米粒子团聚；二是用超净间仪器制备在衬底上的金属纳米结构，例如图1所示的用电子束刻蚀制备的金纳米bowtie结构。

两种体系的单分子SERS一般都是在“干燥”情况下测试染料分子实现的，例如染料分子滴在金纳米bowtie结构上自然干燥再进行拉曼测试；而纳米胶体则先在溶液状态下吸附染料分子再滴在硅片上干燥后得到粒子团聚进行拉曼测试。

然而，干燥状态下测试染料分子跟实际应用相去甚远，一来实际样品测试多在溶液状态进行；二来，染料分子是比较容易测得到的，因为染料分子由于带有苯环所以拉曼散射截面通常比较大，例如是DNA碱基的10 – 100倍。

流动性溶液中测试单分子还有两个问题，一是在纳米间隙中hot spot越强的地方间隙越窄，而分子偏偏喜欢流过间隙宽的地方。二是由于DNA带负电，在加电压的情况下DNA的流动速度快到不容易测到，而不加电压时它又不一定流过hot spot间隙。正因为此，图1只是一个发表于2015年的理论计算模型，到目前仍未见有单分子DNA流过金bowtie结构被测到单分子SERS的实验文章出现，虽然金bowtie结构早已经制造出来了。

成果简介

基于此，意大利理工学院Francesco De Angelis团队改用另外一种策略来实现流体中单分子DNA的测试（图4a）：先让DNA吸附在纳米粒子（图4d）上，再通过加电压施加电等离子体力(electro-plasmonic force, 图4b)把电解液中的纳米粒子推进并约束在金纳米孔（图4c）里，使得纳米粒子与纳米孔壁之间电荷耦合形成电场增强强度达2×10⁴的5 nm左右的纳米间隙hot spot(图4e, f)并激发原来就已经吸附在纳米粒子表面的DNA，实现单分子SERS。

图4. 可控电等离子体约束的微流单分子SERS体系。

要点1：先吸附后成gap的可重复SERS

这个体系的特点是纳米粒子被约束在纳米孔形成的hot spot是可以通过加电压控制的，从而可以实现稳定可重复的SERS测试。图5显示只要加1伏电压就可以把粒子约束在纳米孔里并得到稳定可重复的SERS谱，一旦去掉电压，纳米粒子就会被释放。当纳米粒子表面吸附了多层adenine分子时，作者通过加电压把纳米粒子约束在纳米孔里达6分钟，用每个谱0.1秒的积分时间采集到了相对标准差(RSD)约13%的3600个稳定的SERS谱。

图5. 电压可控的多分子adenine稳定SERS谱。

要点2：史上第一次测全了4个碱基的单分子SERS

确保信号可重复性没问题了，下一步，作者用双组分SERS(BiASER)方法来验证这个SERS体系能否测得到单分子碱基。BiASERS顾名思义，总是需要两个不同类型的分子，可以是cytosin (C)和同位素cytosin (C_iso) 如图6a-c，adenine和guanine(图6d-f)，或者thymine和cytosine (图6g-i)。通过浓度控制，作者将数量相等的两个不同的分子物理吸附在纳米粒子表面上形成submonolayer，然后将纳米粒子放进SERS体系测试。

如图6b,e,h所示，如果形成的hotspot够小，一次只覆盖并激发其中一种分子，那么在特定波段内就能得到该种分子的单个SERS峰。如果形成的hot spot大到足以覆盖两个分子，那么这个hot spot同样会同时覆盖两种分子，得到两个SERS峰的拉曼谱。由于BiASERS是一个基于统计的方法，在采集到至少1000个拉曼谱时(图6a,d,g)，单峰的SERS谱比双峰的SERS谱数量多，就证明了测到单个分子的几率大，实现了单分子SERS，否则就不是单分子SERS。如图6c,f,i所示，作者的体系实现了4个碱基的单分子SERS测试。此外，作者还观察到单分子碱基的动态，例如分子在电场作用下的翻滚(图6d)。

图6. 基于双组分SERS的单碱基SERS测试。

测到了独立吸附的单个碱基证明了hot spot的强度够强了，达到单分子灵敏度了。但是要能识别到DNA链中的单个碱基，还需要hot spot的直径够小，这是个空间分辨率的问题。于是，作者将单链DNA物理吸附在纳米粒子上形成submonolayer做SERS测试，通过测试3种不同的单链DNA：5’-CCC CCC CCC A-3’ (图7), 5’-C AAA AAAAAA-3’ (图8)和5’-AAA AAA AAACTG-3’（图9），作者都测得了对应的单分子碱基SERS峰，证实了这个体系的实用性，且hot spot直径根据最大面积的adenine（1.54 nm²）来估计大概在1.4 nm左右。由于之前图4已经确定hot spot的稳定性，那么图7-9的单碱基峰闪烁和偏移预示着分子在移动，为下一步应用电等离子体力进行单分子操控提供了可能。

图7. 单条5’-CCC CCC CCC A-3’ 吸附在纳米粒子上的单碱基（A）SERS测试。

图8. 单条5’-C AAA AAA AAA-3’吸附在纳米粒子上的单碱基(C)SERS测试。

图9. 单条5’-AAA AAA AAA CTG-3’吸附在纳米粒子上的单碱基SERS测试。

小结

单分子测序这个领域是一个生物学家和生理学家的主场，他们所研究的第三代单分子测序技术和市场产业化很接近，使得研究进展的发表都是非常激动人心的。单分子SERS用在这个领域里非常有意义，因为研究成果不仅仅是用来开开会、发发文章，而是可能可以确实地用来造福社会。

单分子测序研究者普遍使用的工具是膜片夹电流放大器和荧光显微镜，SERS对他们来说还是个新鲜事物。虽然2015年就已经有理论文章（图1）预言了单分子SERS可以解决他们的问题而走向蛋白质测序，但是一直到2018年才出现第一篇测到了adenine的单分子SERS文章，而这一篇Nat. Comm.是第二篇。

目前介绍的数据显示了单碱基的分辨率，但是这只是利用里数据的一部分，数据里峰的位移和闪烁埋藏着流体中分子的更多动力学信息（如分子构型、热效应、电磁场梯度效应等）尚未发掘，这预示着SERS可望在单分子蛋白质测序以及蛋白质组学（Proteomics）上大展拳脚。此外单分子测序还有很多重要问题尚未解决，例如蛋白质展开、减慢蛋白质流速等等。目前我组正在研究氨基酸和多肽的单分子SERS测试，希望有更多SERS同行、单分子/单粒子操控、DFT模拟、分子动力学模拟和生物信息学专家参与和合作，有兴趣的同行欢迎加入“纳米人SERS”QQ群（群号：529847278）来一起探讨。

参考文献

Huang, J., Mousavi, M.Z., Zhao,Y. et al. SERSdiscrimination of single DNA bases in single oligonucleotides byelectro-plasmonic trapping. NatCommun 10, 5321(2019)

DOI: 10.1038/s41467-019-13242-x

https://www.nature.com/articles/s41467-019-13242-x

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